1.實時熒光定量核酸擴增檢測(Real-time Quantitative PCR Detecting System, qPCR)

是常規(guī)聚合酶鏈式反應(yīng)PCR技術(shù)的升級版，通過監(jiān)控PCR反應(yīng)體系中途產(chǎn)生熒光信號的強度，實時監(jiān)測PCR反應(yīng)過程中目標分子的數(shù)量變化。該技術(shù)具有快速、準確、靈敏、高通量和高自動化等特點，廣泛應(yīng)用于基因表達分析、突變檢測、病原體檢測、拷貝數(shù)變異分析等領(lǐng)域。

技術(shù)原理：在PCR反應(yīng)中添加一定濃度的熒光探針，使其與擴增產(chǎn)物靶標的結(jié)合，即可產(chǎn)生強熒光信號。反應(yīng)進行過程中，熒光信號強度與擴增靶標量成正比。PCR反應(yīng)體系中加入雙鏈DNA結(jié)構(gòu)和熒光探針，因此反應(yīng)進行過程中擴增物會降解熒光探針，從而發(fā)出特定的熒光信號。這個熒光信號強度與PCR反應(yīng)體系中反應(yīng)產(chǎn)生的數(shù)量成正比，因此可以通過計量初始模板數(shù)量來對樣本中的總量進行定量。

應(yīng)用領(lǐng)域：檢測DNA和RNA的定量，包括基因表達、突變檢測、體細胞測序、病毒檢測以及細胞壽命檢測等方面。如基因表達定量和分析，研究基因調(diào)控和功能；病毒、細菌和感染性疾病的檢測，追蹤病原體大量表達的特定基因；物種的DNA鑒定、認證和鑒別，如分子生態(tài)學(xué)和食品安全領(lǐng)域；檢測某些人類遺傳疾病、病理性基因突變和癌癥等的診斷和篩查；檢測基因工程產(chǎn)品和轉(zhuǎn)基因食品中的外源基因。

技術(shù)優(yōu)勢：qPCR技術(shù)具有實時監(jiān)測、快速、靈敏、高通量、準確性高、自動化程度高等優(yōu)點。該技術(shù)能夠在PCR反應(yīng)過程中持續(xù)收集和分析熒光信號，實現(xiàn)即時、動態(tài)地監(jiān)測PCR擴增的過程和反應(yīng)結(jié)果。其靈敏度更高，能夠檢測非常低的核酸濃度，檢測下限可達到一兩個分子，同時也可定量非常高的核酸濃度。由于該技術(shù)過程可自動執(zhí)行，每個樣品反應(yīng)時間一致，消除了人為誤差，因此具有很高的準確性、可重現(xiàn)性和準確性等顯著優(yōu)勢，成為分子生物學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)研究的重要工具。

2.流式熒光技術(shù)（Luminex）

是一種基于熒光標記和微珠子技術(shù)的分析方法，能夠快速、高通量地檢測多種生物分子（如蛋白質(zhì)、核酸、激素等）的存在和定量。該技術(shù)采用基于珠子表面標記的識別系統(tǒng)，并通過激光和光傳感器實現(xiàn)對熒光標記的高通量定量。這種技術(shù)廣泛應(yīng)用于基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、細胞生物學(xué)等領(lǐng)域，尤其在臨床診斷和治療方面有著廣泛的應(yīng)用。使用不同染色微球和流式細胞術(shù)原理，可實現(xiàn)同時檢測100個生物標志物。

技術(shù)原理：通過使用不同配比的兩種紅色熒光染料將聚苯乙烯微球染成不同的熒光，獲得多個熒光編碼的微球，進而針對不同待檢測分析物的捕獲抗體共價偶聯(lián)到特定的編碼微球上，加入待檢樣本及生物素標記的抗體，所形成的抗體復(fù)合物再與熒光素PE發(fā)生反應(yīng)，通過Luminex機器采集熒光信號對最后的樣本進行定量。

應(yīng)用領(lǐng)域：Luminex主要應(yīng)用于PD多因子檢測等領(lǐng)域，生物標志物的篩選，癌癥、代謝、免疫、神經(jīng)性疾病的研究等方面發(fā)揮重要作用。

技術(shù)優(yōu)勢：檢測高效，選擇指標多，能夠?qū)崿F(xiàn)核酸和蛋白質(zhì)檢測的應(yīng)用，同一個Panel內(nèi)可自由組合待測因子，可同時檢測數(shù)十種待測分析物；靈敏度高，精確定量下限低至0.1 pg/mL；樣品用量少，只需低至25μL的樣品體積；穩(wěn)定性高，不同組合配有獨特優(yōu)化的緩沖液，可有效減少假陽性；技術(shù)成熟：金標準驗證，與Quantikine進行相關(guān)性驗證，且有QC control對照。

3.流式細胞術(shù)(Flow cytometry)

該技術(shù)操作簡便、靈敏度高、定量準確，已廣泛應(yīng)用于細胞生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)研究，它在免疫治療生物標志物的檢測與研究中發(fā)揮了重要作用。

技術(shù)原理：將全血、組織樣本等制成單細胞懸液，細胞在流式細胞儀的激光的照射下產(chǎn)生相應(yīng)的散射光和激光信號，計算機分析系統(tǒng)會接收的不同光信號進行分析處理。

應(yīng)用領(lǐng)域：流式在細胞DNA含量檢測、細胞表型分析、細胞功能分析、細胞表面或胞內(nèi)蛋白分析、紅細胞疾病的診斷、可溶性蛋白檢測、細胞的分選等發(fā)揮重要作用；細胞動力學(xué)研究（抗體修飾NK細胞，CAR-T/NK細胞等）；抗體內(nèi)吞研究等。

技術(shù)優(yōu)勢：對單個細胞或生物顆粒進行快速、逐個檢測、測量速度可達每秒數(shù)千甚至上萬個細胞；靈敏度高，每個細胞上只需帶有1000~3000個熒光分子即可檢測出來；精密度高，相比其他檢測技術(shù)，流式的變異系數(shù)更小，分辨率更高，可在保證細胞不被破壞的情況下進行分析；可以把制定特征的細胞分選出來，分選細胞的純度可達99%以上。

4.酶聯(lián)免疫分析（ELISA）

是一種利用特異性抗體和酶的偶聯(lián)反應(yīng)檢測生物分子的技術(shù)。很早被應(yīng)用于體液樣本臨床蛋白標志物檢測的技術(shù)，使用簡單方便，在實驗室應(yīng)用廣泛，已經(jīng)使用了幾十年，因而也被當(dāng)成“金標準”來使用。酶聯(lián)免疫分析類型包括：直接法(Direct ELISA)、競爭法(Competitive ELISA)、間接法( Indirect ELISA )和夾心法(Sandwich ELISA)。

技術(shù)原理：使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測定時，把受檢標本（測定其中的抗體或抗原）和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺刊物定性或定量分析。由于酶的催化頻率很高，故可極大地地放大反應(yīng)效果，從而使測定方法達到很高的敏感度。

應(yīng)用領(lǐng)域：細胞因子檢測，如白介素、選擇素、集落刺激因子，腫瘤壞死因子，干擾素，轉(zhuǎn)化生長因子，趨化因子，細胞因子受體，粘附分子，生長因子，凋亡因子等；心肌梗塞檢測，如肌鈣蛋白，肌紅蛋白，C-反應(yīng)蛋白等；內(nèi)分泌檢測，如甲狀腺，胰腺，性激素，孕酮，睪酮，生長激素，生長抑素，內(nèi)皮素，皮質(zhì)醇，骨鈣素，催乳素，促腎上腺皮質(zhì)激素，促卵泡素，雌二醇，雌三醇，5-羥色胺，17-羥孕酮等；肝纖維化檢測，如纖維連接蛋白，透明質(zhì)酸，膠原，基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子，基質(zhì)金屬蛋白酶，層粘蛋白等；自身免疫檢測，如甲狀腺，鹽水可提取核抗原抗體(ENA)，抗核抗體，DNA，抗心磷脂抗體，類風(fēng)濕因子，循環(huán)免疫復(fù)合物，抗胰島細胞抗體，胰蛋白酶原，Sm，大皰性類皰瘡，ELISA試劑盒蛋白酶，短膜蟲法，肝-腎，肝-腎-胃，肌內(nèi)膜抗體，角蛋白抗體，抗核抗體，抗核糖體蛋白抗體，抗聚角蛋白微絲蛋白抗體，抗鏈O，抗卵巢抗體，抗平滑肌抗體，抗線粒體抗體等。

技術(shù)優(yōu)勢：操作簡單，且樣品處理方便，且其對于分析物的靈敏度高、特異性好，而且檢測結(jié)果快速且準確可靠，能夠被自動化的處理和分析。

5.電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)器（MSD）

利用電化學(xué)發(fā)光原理，靈敏度高、背景低、線性范圍廣。同時通過每個小孔不同位點包被不同抗體來實現(xiàn)多重檢測，一次可以檢測10個多因子。

技術(shù)原理：MSD電化學(xué)發(fā)光技術(shù)檢測技術(shù)使用SULFO-TAG標記物，在MULTI-ARRAY和MULTI-SPOT微孔板的電極表面通電后，電化學(xué)作用激發(fā)SULFO-TAG標記物發(fā)出強光。

應(yīng)用領(lǐng)域：MSD主要應(yīng)用于PK（靈敏度要求高的藥物）、ADA、PD多因子檢測等領(lǐng)域。在心腦血管疾病、免疫/炎癥、代謝性疾病、神經(jīng)退行性疾病、癌癥、細胞內(nèi)信號通路等研究相關(guān)領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，涉及HER2、PD-1/PD-L1等熱門靶點。

技術(shù)優(yōu)勢：MSD為電化學(xué)發(fā)光，具有更好的信噪比；具有更寬的檢測范圍；同一反應(yīng)孔內(nèi)可進行多個因子的檢測；具有嚴格的質(zhì)控檢測試劑。

6.免疫組化（IHC）

一種廣泛應(yīng)用于組織和細胞研究中的技術(shù)，它可以為研究人員提供有關(guān)細胞類型、分子組成、表達和亞細胞定位的重要信息。IHC可用于許多疾病研究和分子診斷，是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的一項重要工具。

技術(shù)原理：利用抗體的特異性與組織或細胞中的特定抗原結(jié)合，并通過標記物（如酶或熒光）的特異性檢測抗原的位置和表達情況。IHC主要包括以下步驟：樣品處理、抗原恢復(fù)、阻斷和抗體處理、標記物檢測、暴露和成像等。

應(yīng)用領(lǐng)域：檢測組織和細胞中的蛋白質(zhì)表達情況以及定位，可以了解蛋白質(zhì)的分布情況、表達量和亞細胞定位等信息。特別是在癌癥的研究中，可以用于診斷、估計患者的預(yù)后情況以及選擇治療方式。除此之外，IHC 技術(shù)還可應(yīng)用于檢測細胞信號傳導(dǎo)、炎癥反應(yīng)、自身免疫性疾病、感染病等等。

技術(shù)優(yōu)勢：樣品處理簡單，操作性較強；只需要少量的樣本就可以開展實驗；可以同時檢測多種不同的物質(zhì)；可以使用多種常規(guī)的組織染色方法，如熒光染色、酶標記染色等等。

7.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）

結(jié)合了液相色譜的分離能力和質(zhì)譜的分析能力，可以高靈敏和高選擇性的進行化合物的分析，是目前在生物分析領(lǐng)域中廣泛使用的高通量分析技術(shù)。

技術(shù)原理：液相色譜用于分離復(fù)雜樣品，質(zhì)譜檢測器用于檢測分離后的化合物，以確定分子的質(zhì)量和結(jié)構(gòu)。

應(yīng)用領(lǐng)域：用于分離和鑒定某種特定化學(xué)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和含量，如不揮發(fā)性化合物、極性化合物、熱不穩(wěn)定化合物、大分子量化合物（包括蛋白、多肽、多聚物等）的分析測定。被廣泛應(yīng)用于許多領(lǐng)域，如臨床診斷、藥物研發(fā)、食品安全、環(huán)境污染等。

技術(shù)優(yōu)勢：檢測靈敏度高，能夠檢測到低濃度的化合物甚至輕微的化學(xué)變化；顯著提高了檢測效率和準確性，尤其適用于樣品分離和分析；能夠同時鑒定和定量多種化學(xué)物質(zhì)，提供更詳細和全面的分析結(jié)果；操作簡單、效率高和可重復(fù)性好，且標準化程度較高，可以大規(guī)模生產(chǎn)和商業(yè)化應(yīng)用。

結(jié)語

在藥物研發(fā)的不同階段，生物標志物均有廣泛的運用。生物標志物可用于候選藥物的篩選，減少藥物研發(fā)成本，避免藥物在后期臨床階段失敗的重大損失。生物標志物還可用于疾病的鑒定和診斷、病人篩選和治療效果預(yù)測、監(jiān)控治療進程和疾病進程以及反映治療效果等各個方面。

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